鸡毒支原体两种膜相关糖酵解酶的生物学功能研究

【摘要】鸡毒支原体Mycoplasmagallisepticum)是重要的禽病原体之一,主要引起鸡的慢性呼吸道疾病和火鸡传染性窦炎。由于缺乏三羧酸循环途径中的很多酶,通过糖酵解途径获取能量对于这类缺乏细胞壁的微生物来讲就显得尤为重要。醛缩酶(adolase,FBA)和丙酮酸激酶(pyruvatekinase,pykF)是糖酵解途径的两个关键酶之一,但它们在支原体中的功能尚不清楚,本文将开展其生物学功能的研究。1.醛缩酶的生物学功能研究根据已发表的鸡毒支原体醛缩酶基因序列,设计特异性的引物,以鸡毒支原体R1ow株基因组为模板,通过OverlapPCR点突变扩增鸡毒支原体fba基因,将fba克隆至pET28a(+)载体后进行序列测定和分析。结果表明,fba全长873bp,编码290个氨基酸。将构建的重组表达质粒pET28a-fba转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白rMGfba,大小约为33kDa。纯化蛋白并对蛋白进行酶活性检测,结果显示该酶在体外具有与阳性对照醛缩酶相同的催化功能。同时用该蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体。提取鸡毒支原体膜蛋白,Western-blot显示FBA多抗血清可与该膜蛋白发生特异性结合；免疫胶体金电镜结果进一步说明了FBA位于鸡毒支原体膜表面。同时表达荧光蛋白和FBA的E.coli-fba-gfp重组菌株可黏附禽DF-1细胞,且FBA多抗血清对支原体黏附宿主细胞的阻断率达42.68%,说明了醛缩酶可介导支原体黏附宿主细胞,这为进一步研究该酶的功能奠定了基础。2.丙酮酸激酶的生物学功能研究为了研究丙酮酸激酶的生物学功能,我们利用pET系统首先原核表达了该蛋白。将PCR扩增的pykF基因插入pET28a(+)载体构建重组表达质粒pET-pykF,将鉴定为阳性的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)构建重组菌E.coli-pykF,重组菌在IPTG诱导下成功获得融合蛋白rMGpykF,表达的蛋白经SDS-PAGE分离后用考马斯亮蓝染色,结果显示该蛋白大小约为60kDa,与预期结果相符。纯化蛋白并对蛋白进行酶活性检测,结果显示该酶具有与阳性对照丙酮酸激酶相同功能,都可催化NADH形成NAD+,说明鸡毒支原体中pykF基因编码丙酮酸激酶。用纯化的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,免疫印迹反应和免疫电镜结果都显示丙酮酸激酶存在于鸡毒支原体膜表面。同时用鸡毒支原体阳性血清孵育转印有表达丙酮酸激酶的E.coli-pykF全菌蛋白的NC膜,结果有阳性条带出现,说明丙酮酸激酶是一个免疫原性蛋白；补体介导的细胞毒试验显示丙酮酸激酶血清有66.16%的杀菌效率,说明该酶对机体可产生较好的免疫保护力。为了进一步探明作为膜蛋白的丙酮酸激酶的功能,构建了同时表达荧光蛋白和丙酮酸激酶的重组菌株E.coli-pykF-gfp,利用细菌感染DF-1细胞来体外模拟支原体感染细胞,结果显示只有表达丙酮酸激酶的阳性重组菌才能黏附DF-1细胞,且丙酮酸激酶多抗血清具有明显的阻断支原体黏附宿主细胞的作用,阻断率达39.13%,说明作为膜蛋白的丙酮酸激酶在支原体黏附宿主细胞的过程中可能发挥黏附作用。
【作者】何随彬；
【导师】费荣梅；丁铲；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】鸡毒支原体；醛缩酶；丙酮酸激酶；膜蛋白；黏附；免疫学特性；

【参考文献】
[1]杨天博.铁芯式直线电机定位力扰动的模型辨识与补偿方法[D].哈尔滨工业大学,控制工程,2014,硕士.
[2]领梅.基于ALOS与TM数据的凉城县土地利用分类研究[D].内蒙古农业大学,森林经理学,2013,硕士.
[3]李硕果.脉冲式近红外无创检测技术研究初探[D].四川农业大学,生物物理学,2012,硕士.
[4]王洁.2010年泰州市20~39岁成年人体质研究[D].南京师范大学,运动人体科学,2012,硕士.
[5]易俗.不同共情能力与群体恐慌情境对恐惧视频材料认知评价的影响[D].湖南师范大学,应用心理学,2013,硕士.
[6]王煦法.浅谈针对审计风险的若干新思想和新方法[J].中国审计,2004,17:32-33.
[7]王红亮.新型阿尔茨海默病和细胞凋亡正电子发射断层显像剂的研究[D].天津大学,2010.
[8]李兵.野桑蚕体内分离的NPV和BmNPV的比较研究[D].苏州大学,特种经济动物饲养,2003,硕士.
[9]习小俊.免蒸压预应力高强混凝土管桩混凝土配合比研究[D].南昌大学,建筑与土木工程（专业学位）,2012,硕士.
[10]何俊.基于复杂网络理论的电力系统连锁故障分析[D].东北电力大学,电气工程,2013,硕士.
[11]邹新春.昆明医科大学附属口腔医院服务营销策略研究[D].云南大学,工商管理,2012,硕士.
[12]汪廷华,田盛丰,黄厚宽.特征加权支持向量机[J].电子与信息学报,2009,03:514-518.
[13]钟伟平.基于UML的警员日常考核管理系统设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[14]韩娜娜.喀什维吾尔族传统花帽艺术研究[D].新疆师范大学,美术学,2013,硕士.
[15]王卫.区域劳务品牌对中国农村劳动力转移的影响研究[D].东北林业大学,农业经济管理,2014,博士.
[16]辛菲.鲅鱼皮胶原蛋白的提取及分子特性的初步研究[D].新疆农业大学,分子生物学与生物化学,2012,硕士.
[17]高伟.玉米光周期反应与类LFY基因克隆的研究[D].河南农业大学,作物遗传育种,2004,硕士.
[18]余成秀.IgG4与系统性红斑狼疮发病机制的初步研究[D].川北医学院,内科学,2013,硕士.
[19]王艺儒.初中生英语写作中母语负迁移现象的调查[D].渤海大学,课程与教学论,2014,硕士.
[20]蒋玉杰.泳动型机器人的结构规划及其相关问题研究[D].东北大学,2005.
[21]刘伟.田山灌区水资源优化配置研究[D].山东大学,水利工程（专业学位）,2013,硕士.
[22]李玲玲.新型研发组织的运行与绩效评价研究[D].武汉理工大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[23]邱文教,潘晓卉.数据挖掘技术在教务管理中的应用[J].安徽工业大学学报(社会科学版),2005,03:133-134.
[24]李莹.新世纪汉语新兴称谓词语的多维视角研究[D].曲阜师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[25]马文涛.支气管肺泡灌洗液中（1，3）-β-D葡聚糖检测对侵袭性肺部真菌病诊治价值的研究[D].郑州大学,内科学,2013,硕士.
[26]刘小宇.基于FPGA的图像连通域处理的研究[D].哈尔滨工业大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[27]郑佳晶.基于ARM的多媒体网络通信操作终端的研究[D].东北大学,检测技术与自动化装置,2011,硕士.
[28]于国磊.水淹对克隆植物空心莲子草种内关系的影响[J].植物生态学报,2011,09:973-980.
[29]潘明孝.越南宗教旅游开发研究[D].天津大学,旅游管理,2013,硕士.
[30]雒成焱.湿陷性黄土地区夯实水泥土桩复合地基承载及变形性状研究[D].西安建筑科技大学,结构工程,2013,硕士.
[31]朱平.螺旋锥齿轮齿面的电化学光整加工工艺基础研究[D].新疆大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[32]张洪霞.小学数学计算教学策略研究[D].东北师范大学,教育,2012,硕士.
[33]张熙林.对“海外兵团”对乒乓球运动发展所作出的积极影响与贡献的研究[D].吉林体育学院,体育教育训练学,2013,硕士.
[34]杨月颖.先秦儒家德育思想在高校德育中的价值及运用[D].河北师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[35]史彩云.天然染料的一浴法拼色染色技术研究[D].苏州大学,纺织化学与染整工程,2012,硕士.
[36]何春兰.石墨烯制备及其电催化应用[D].重庆大学,2012.
[37]万武波,赵宗彬,范彦如,胡涵,周泉,邱介山.石墨烯衍生物的合成及应用[J].化学进展,2011,09:1883-1891.
[38]宁春丽.中阶梯光栅光谱仪结构优化设计与像质分析[D].中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）,光学,2012,硕士.
[39]马达君.软土地区盾构隧道施工引起地表沉降的理论与数值研究[D].浙江工业大学,2010.
[40]陈家贵.我国现行征地制度分析与对策研究[D].西南农业大学,土壤学,2004,硕士.
[41]赵晨光.永磁同步发电机及在混合动力汽车中的应用研究[D].广东工业大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[42]梁志红.中油燃料沥青有限公司战略性人力资源规划研究[D].燕山大学,工商管理,2013,硕士.
[43]张超.固体氧化物燃料电池La(NiFe)O_3基阳极材料的研究[D].中国矿业大学,化学工程与技术,2014,硕士.
[44]吴游.相变存储器芯片外围电路设计及寄生效应研究[D].华中科技大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[45]王先柱.房地产市场货币政策区域效应——基于我国31个省市的实证分析[J].山西财经大学学报,2011,10:52-61.
[46]蒋黎茉.袁采与《袁氏世范》研究[D].东北师范大学,中国古典文献学,2012,硕士.
[47]吕爱芃.富营养化水体微生物生态修复技术研究[D].北京建筑大学,环境工程,2013,硕士.
[48]罗改霞.锂离子电池与超级电容器电极材料的理论研究[D].大连理工大学,2013.
[49]陈晨.跆拳道道馆运营模式给予中国武术发展的启示[D].云南师范大学,民族传统体育学,2013,硕士.
[50]何彤宇.基于分布式数据库的网络教学资源系统设计与研究[D].贵州师范大学,2004.